| Реферат |
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения сроков сохранения жизнеспособности грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas, включающий выращивание бактерий рода Pseudomonas в питательной среде, в течение 48 ч при 28 °С с постоянным перемешиванием при 230 об/мин, где питательная среда включает хлорид натрия, триптон, дрожжевой экстракт, воду дистиллированную и осмопротектор L-пролин при заданном содержании исходных ингредиентов. Изобретение обеспечивает повышение сроков сохранения жизнеспособности грамотрицательных бактерий. 3 ил., 3 пр.
Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения культур бактерий с продленным сроком сохранения высокого титра живых клеток.
Уровень техники.
В настоящий момент в России зарегистрировано 30 биопрепаратов против болезней пасленовых (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, 2023), из которых больше половины содержат споры/клетки Bacillus (15 препаратов), Trichoderma (6 препаратов) и штаммы грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas (5 препаратов).
Одним из факторов, ограничивающих широкое использования микробиологических препаратов - это небольшой срок хранения и значительное снижение титра жизнеспособных клеток при неблагоприятных метеорологических условиях. Если препараты на основе бацилл относительно стабильны из-за образования покоящихся форм клеток (спор), то препараты на Основе бактерий с грамотрицательным типом клеточной стенки (например, Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Serratia) - наиболее уязвимая группа микроорганизмов.
В этой связи, представляется актуальным разработка способов получения культур микроорганизмов, адаптированных к нестабильным и неблагоприятным условиям агроценозов.
Известен способ увеличения срока годности биоудобрения на основе клубеньковых бактерий (источник [1]: патент RU 2610309). Способ заключается в использовании технологии лиофилизации бактериальных культур и возможности их последующей регенерации и наращивания на питательных средах непосредственно перед обработкой ими посевного материала. Недостатком известного способа является необходимость восстановления (регидратации) микроорганизмов перед использованием.
Известно изобретение «Жидкие бактериальные инокулянты с повышенным сроком годности и повышенной стабильностью на семенах» (источник [2]: патент RU 2428467), состоящего из жидкого инокулянта бактерий, обезвоживающей добавки, включающей десикант, где десикант представляет собой одно или несколько соединений, выбранных из трегалозы, сахарозы, глицерина, триэтиленгликоля и маннита, в количестве от примерно 5% до примерно 50% (мас./об.).
Известен самоконсервирующийся биопрепарат для защиты растений от болезней (варианты) и способ его получения (источник [3]: патент RU 2380906). Споросодержащий препарат грибов рода Trichoderma готовят путем добавления на стадии ферментации вещества, способствующего спорообразованию. Отличительной чертой заявляемого изобретения является повышение осмотолерантности (устойчивости к высушиванию) грамотрицательных микроорганизмов путем выращивания их на среде с добавления осмопротектора.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ повышения выживаемости и эффективности бактериального средства биоконтроля бактериального ожога розоцветных путем осмоадаптации, (режим доступа: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17391328/). Осуществляют процедуру, состоящую из адаптации клеток к солевым и/или кислым условиям pH во время приготовления бактерий Lactobacillus или добавлением осмопротектора глицина при выращивании Pseudomonas fluorescens.
Сущность изобретения.
Техническая проблема заключается в необходимости разработки питательной среды для выращивания культур бактерий с продленным сроком сохранения высокого титра живых клеток.
Техническая проблема заключается в необходимости разработки способа выращивания культур бактерий с продленным сроком сохранения высокого титра живых клеток.
Технический результат заключается в повышении эффективности применения биопрепаратов на основе живых бактерий за счет повышения сроков сохранения жизнеспособности грамотрицательных бактерий.
В способе получения культур бактерий с продленным сроком сохранения высокого титра живых клеток осуществляют выращивание бактерий в питательной среде в течение 48 часов при температуре 28 °C с постоянным перемешиванием при 230 об/мин, где питательная среда для выращивания культур бактерий с продленным сроком сохранения высокого титра живых клеток включает хлорид натрия, триптон, дрожжевой экстракт и воду, дополнительно содержит осмопротектор L-пролин, при следующем содержании ингредиентов:
L-пролин 0,115 - 1,150 г
хлорид натрия 29,2 г
триптон 10 г
дрожжевой экстракт 5 г
вода дистилированная 1 л
Предусмотрено, что в качестве культур бактерий берут грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas.
Предусмотрено, что в качестве культур бактерий берут грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas brassicacearum.
Осуществление изобретения.
Для приготовления заявляемой питательной среды берут L-пролин 0,115 - 1,150 г, хлорид натрия 29,2 г, триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г и добавляют 1 л дистиллированной воды. Раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 2 атмосферах, 120 °С, 20 минут.
Использование в предлагаемой питательной среде в качестве осмопротектора L-пролина повышает осмотолерантность бактерий.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1.
Для выращивания бактерии Pseudomonas protegens CV3 и Pseudomonas brassicacearum RCAM05391 использовали варианты питательных сред со следующим составом (грамм на 1 литр среды):
Вариант среды № 1. L-пролин - 0,115 г; NaCl - 29,2 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Вариант среды № 2. L-пролин - 0,575 г; NaCl - 29,2 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Вариант среды № 3. L-пролин - 1,150 г; NaCl - 29,2 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Вариант среды № 4. NaCl - 29,2 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Вариант среды № 5. NaCl - 40,88 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Вариант среды № 6. Коммерческая среда LB (Диаэм, Россия): NaCl - 5 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр.
Осмоадаптированность бактериальных культур, полученных на питательных средах №№ 1,2,3, содержащих L-пролин, оценивали путем сравнения показателей их роста относительно культур, полученных при выращивании на стандартной среде LB. Для этого полученные на варианте среды №№ 1,2,3 клетки бактерий отмывались от остатков питательных сред и ресуспенидровались в водном растворе натрия хлорида (5 г/л). Далее клетки бактериальных культур доводили до оптической плотности суспензии, соответствующей количеству клеток - 106 КОЕ/мл и использовали как иннокулюм. В микропланшеты на 96 лунок вносили 90 мкл питательной среды № 4 или № 5 и 10 мкл суспензии бактериальных клеток (иннокулюм). При выращивании в микропланшетах каждые 15 минут в автоматическом режиме измеряли показатель оптической абсорбции (мутности) при 620 нм в спектрофотометре Multiscan Go (Thermo, США).
На фиг. 1 приведены графики роста культур Pseudomonas protegens CV3, полученных на среде №№ 1, 2, 3, а также на среде № 6 LB, и на среде № 4 условиях гиперосмоса (Фиг. 1А). При выращивании бактерий на среде с добавлением L-пролина в концентрации 1мМ в сочетании с присутствием в среде натрия хлорида в концентрации 0,5М (среда № 1), клетки бактерий эффективно накапливают осмопротектор (L-пролин), что при последующем их культивировании в условиях гиперосмоса (среда №4) позволяет добиться увеличения в показателях выхода биомассы (Фиг. 1Б) микробных клеток по сравнению с клетками, полученными на обычной среде (среда № 6 LB) (Фиг. 1). При этом, более высокие концентрации осмопротектора L пролина (среды № 2 и № 3) в среде культивирования оказывают сравнимый эффект.
Пример 2.
Эффективность осмоадаптации бактериальных клеток при их выращивании на среде № 1 также апробирована на бактериях вида Pseudomonas brassicacearum RCAM05391 (Фиг. 2). Для этого сравнивались показатели роста бактериальных культур на средах № 4 (Фиг. 2А) и № 5 (Фиг. 2Б). Показатели роста (Фиг. 2А, Б) и выхода биомассы клеток (Фиг. 2В) свидетельствуют, что состав среды № 1 позволяет выращивать различные виды грамотрицательных бактерий, адаптированные к условиям гиперосмоса.
Изобретение поясняется иллюстративными материалами.
Фиг. 1 - Сравнение динамики роста культуры клеток P. protegens CV3, полученных на разных средах (фиг. 1А). Графики роста получены путем записи показателей абсорбции света в лунках планшета на длине волны 620 нм при росте бактерий на среде № 4 с содержанием натрия хлорида 0,5М. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. (фиг. 1Б) Биомасса клеток P. protegens CV3 по окончании культивирования при выращивании в среде №4. Данные представлены в процентном отношении к контролю (бактерии, выращенные на среде LB).
Фиг. 2. - Сравнение динамики роста осмоадаптированной культуры клеток P. brassicacearum RCAM05391, при выращивании на среде № 4 (фиг. 2А) и среде № 5 (фиг. 2Б). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. (фиг. 2B) Биомасса клеток P. brassicacearum по окончании культивирования в средах №4 и № 5. Данные представлены в процентном отношении к контролю (бактерии, выращенные на среде LB).
Фиг. 3. Диаграмма выживаемости бактерий, полученных при выращивании на среде, содержащей L-пролин и среде LB на поверхности стерильной фольги в условиях относительной влажности 40±5%. Данные показаны как процентное соотношение КОЕ / мл контрольного варианта к опытному.
Осуществление изобретения.
Способ позволяет продлить сохранность живых клеток грамотрицательных бактерий в условиях пониженной влажности путем выращивания целевых культур в среде с добавлением осмопротектора аминокислоты L-пролина. Способ позволяет сохранить титр живых клеток и таким образом повысить эффективность применения биопрепаратов на основе живых бактерий в области растениеводства, а также в других областях, связанных с использованием микробиологических продуктов.
Для выращивания бактерии Pseudomonas protegens CV3 и Pseudomonas brassicacearum RCAM05391 использовали питательную среду со следующим составом (грамм на 1 литр среды):
L-пролин - 0,115 г; NaCl - 29,2 г; триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; дистиллированная вода - 1 литр. Раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 2 атмосферах, 120 °С, 20 минут. Далее бактерии культивируют в течение 48 ч при 28 °C с постоянным перемешиванием при 130 об/мин.
Пример 3.
На фиг. 3 представлены кривые выживаемости (содержания жизнеспособных) клеток на поверхности стерильной фольги в условиях пониженной влажности. Суспензию выращенной культуры в питательной среде, содержащей L-пролин, по заявляемому способу в объёме 100 мкл наносили на поверхность стерильной фольги и помещали в стеклянные чашки Петри. Чашки инкубировали в климатической камере в условиях относительной влажности 40±5% и температуры 28 °С в течение 48 часов с постоянным перемешиванием при 230 об/мин. Через равные промежутки времени смывали клетки водным раствором натрия хлорида (5 г/л) и рассеивали на агаризованную среду с целью подсчёта количества жизнеспособных клеток (КОЕ/мл).
При инкубировании клеток на твердой поверхности показатель КОЕ снижался на 30 %, в течение двух месяцев инкубирования, в свою очередь, показатель КОЕ в экспериментальном варианте сохранял свое значение на первоначальном уровне (фиг. 3).
Формула изобретения
Способ повышения сроков сохранения жизнеспособности грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas, характеризующийся тем, что осуществляют выращивание бактерий рода Pseudomonas в питательной среде, в течение 48 ч при температуре 28 °С с постоянным перемешиванием при 230 об/мин, где питательная среда, включающая хлорид натрия, триптон, дрожжевой экстракт и воду, содержит осмопротектор L-пролин, при следующем содержании исходных ингредиентов:
L-пролин 0,115-1,150 г
хлорид натрия 29,2 г
триптон 10 г
дрожжевой экстракт 5 г
вода дистиллированная 1 л
|
