| Аннотация |
Целью проекта является создание центра компетенций по морской микробиологии на базе существующей биоресурсной коллекции «Коллекция морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН» для осуществления исследовательской, образовательной, экспертной и координационной деятельности в области изучения и использования морских микробных биоресурсов, сохранения и обеспечения регулируемой доступности ценных образцов генетических ресурсов морских микроорганизмов, в том числе в рамках сетевого взаимодействия профильных коллекций.
Задачи развития биоресурсной коллекции в рамках реализации проекта:
1. Сохранность, каталогизация, изучение и рациональное использование генетических ресурсов коллекционных материалов – морских бактерий и грибов-микромицетов различных местообитаний.
2. Развитие и пополнение биоресурсной коллекции образцами/ штаммами и изолятами, собранными в ходе морских и береговых экспедиций, а также переданных путем обмена или покупки у профильных российских или зарубежных коллекций. Депонирование штаммов.
3. Совершенствование стандартов систематизации сбора и хранения ценных образцов генетических ресурсов морских микроорганизмов.
4. Развитие информационной инфраструктуры биоресурсной коллекции для эффективного управления коллекционным материалом, обеспечения доступности, узнаваемости и востребованности коллекции пользователями, в том числе в рамках сетевого взаимодействия.
5. Молекулярно-генетическая идентификация и валидная публикация новых и хранящихся штаммов биоресурсной коллекции.
6. Проведение фундаментальных исследований в области сравнительной геномики морских микроорганизмов и метагеномики морских сообществ.
7. Проведение фундаментальных исследований в области изучения биологически-активных соединений морских микроорганизмов в интересах биомедицины и сельского хозяйства.
8. Проведение фундаментальных исследований в области поиска и применения новых ферментов морских микроорганизмов для получения соединений с заданными свойствами в интересах биофармацевтики и биотехнологии.
9. Подготовка кадров в области морской микробиологии, геномики, биоорганической химии и молекулярной биотехнологии.
10. Участие в развитии нормативной базы по определению ценных коллекционных фондов морских микробных биоресурсов, необходимых для исследовательских и прикладных задач.
Выполнение данного проекта будет осуществляться с использованием традиционных и современных методов и подходов микробиологии, молекулярной биологии (включая геномику), биохимии, физико-химической биологии (включая метаболомику), и биоинформатики. Для развития биоресурсной коллекции в соответствии с целью и задачами данного проекта планируется проведение работ по следующим направлениям:
1. В рамках развития биоресурсной коллекции морских микроорганизмов и проведения фундаментальных исследований в области генетического разнообразия морских микроорганизмов планируются работы по сохранности и каталогизации штаммов (не менее 450), пополнению и характеризации штаммов морских микроорганизмов (не менее 300). Будет проведена генетическая идентификация не менее 450 коллекционных штаммов морских микроорганизмов и не менее 300 штаммов из экспедиционных образцов. Оценены основные культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штаммов микроорганизмов, добавлена информация о не менее 240 штаммах в каталог коллекции с оформлением паспорта штамма. Для расширения функциональности Коллекции будет разработана документация на депонирование штаммов. Будут продолжены исследования филогенетического разнообразия, культуральных и физиологических свойств не менее 150 штаммов, выделенных из морского льда Японского моря, глубоководных донных осадков Японского, Охотского и Чукотского морей, а также выделенных из водорослей и морских гидробионтов Японского и Охотского морей. Определены кандидаты на описание новых таксонов. Исследования биоразнообразия морских объектов будут дополнены использованием методами ампликонного секвенирования микробиомов. Будут получены и проанализированы микробиомы образцов морского грунта Охотского и Чукотского морей, акваторий полуострова Камчатка, водорослей Японского и Охотского морей (Курильские острова) и морских гидробионтов Японского моря. Результатом будут являться данные о филогенетическом разнообразии штаммов микроорганизмов и представление о микробных сообществах российских окраинных морей. Будет выполнено сопровождение информационной системы «Биобанк КММ» и проведено развитие функциональности сайта КММ ТИБОХ ДВО РАН: добавлена подсистема переключения режимов отображения информации «русский / английский язык»; разработаны профили пользователей организаций сетевого взаимодействия, а также разработаны учебные материалы «Цифровизация биобанкирования». Будет проведен ремонт помещений, непосредственно связанных с осуществлением проекта, в т. ч. предназначенных для работ с биологическим и генетическим материалом и хранения коллекционного материала.
Для генетической идентификации культивируемых штаммов будет применяться секвенирование генов по Сэнгеру с помощью генетических анализаторов SeqStudio (Applied Biosystems, США) и 3130xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Секвенирование геномов отобранных штаммов будет проводиться с использованием технологий Illumina и Oxford Nanopore.
2. В рамках проведения фундаментальных исследований в области сравнительной геномики морских микроорганизмов и морских сообществ будет выделена геномная ДНК и проведено секвенирование геномов не менее 15 типовых штаммов, не менее 45 штаммов-кандидатов на новые таксоны и не менее 30 потенциальных штаммов-продуцентов ферментов и соединений с высоким биотехнологическим потенциалом. Проведен биоинформатический анализ геномных последовательностей ценных образцов генетических ресурсов морских микроорганизмов. Проведен филогеномный и пангеномный анализы для описания новых таксонов. Идентифицированы кластеры генов, связанные с синтезом, деградацией и модификацией различных полианионных полисахаридов. Предсказаны потенциальные функции ферментов. Оценено разнообразие гидролитических ферментов и представленность биосинтетических генных кластеров вторичных метаболитов в геномах штаммов морских бактерий КММ. Результатом будут являться данные по биосинтетическому, биомедицинскому и биотехнологическому потенциалу штаммов морских микроорганизмов, по описанию новых и реклассификации известных таксонов морских микроорганизмов.
Поиск биосинтетических генных кластеров будет осуществляться с использованием локально развернутого алгоритма antiSMASH, а поиск CRISPR-систем – при помощи CRISPR/Cas Finder, нахождение бактериальных секреционных систем – MacSyFinder с модулем TXSScan. Поиск ферментов (CAZymes) будет предсказан при помощи сервера dbCAN3, а аннотация кластеров на сервере dbCAN-PUL. Анализ ортологичных генных кластеров будет проводиться с использованием серверов OrthoVenn3 и Anvi’o-8.0.
3. В рамках проведения фундаментальных исследований в области изучения биологически-активных метаболитов морских микроорганизмов будут продолжено выделение низкомолекулярных вторичных метаболитов из грибов-микромицетов и бактерий, хранящихся в коллекции, а также изучение биологической активности выделенных соединений. Анализ химического состава экстрактов будет проводится методами ТСХ и ВЭЖХ МС. Для выделения индивидуальных соединений будут использоваться различные варианты сорбционной и гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, а также ВЭЖХ на прямой, обратной и хиральной фазах. Для установления структуры выделенных метаболитов будут использоваться различные методы одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии (1H и 13C ЯМР, DEPT, COSY-45, HSQC, HMBC, TOCSY и т.д.) и масс-спектрометрии высокого разрешения с различными типами ионизации. Установление относительной и абсолютной конфигурации стереоцентров выделенных соединений будет осуществляться как химическими методами (хиральная дериватизация по методу Мошера, метод Мерфи для анализа конфигурации аминокислот в пептидах и алкалоидах), так и различными спектральными методами (рентгеноструктурный анализ, NOESY, КД), а также квантово-химические расчеты с использованием теории функционала плотности, реализованные в программном комплексе Gaussian 16. Ингибирующая активность в отношении уреазы (из Canavalia ensiformis, 1U) будет оцениваться по выделению аммиака с использованием индофенольного метода. Регуляция роста растений будет оцениваться влиянием соединений на всхожесть семян овощей и кормовых трав, рост проростков и растений, уровень хлорофилла, урожайность и другие показатели. Кроме того, влияние соединений, ингибирующих активность уреазы, на разложение азотных удобрений в почве будет оцениваться по образованию аммиака в воздухе в закрытой камере. В экспериментах в необходимых условиях культивирования будут использованы следующие линии клеток: нормальные кератиноциты человека HaCaT, нормальный бронхиальный эпителий человека Beas-2, эпителий молочной железы человека MCF-10A, а также клетки рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-231. Наиболее активные соединения будут протестированы in vivo с использованием мышиной солидной карциномы Эрлиха. Мышам будут прививаться клетки карциномы, и животные далее будут проходить лечение активным соединением. Исследование будет планироваться в соответствии с современными рекомендациями 3R подхода для животных моделей опухолевых процессов. Все эксперименты с участием животных будут проводиться под контролем Этического комитета ТИБОХ ДВО РАН в строгом соответствии с правилами гуманного обращения.
В рамках работ по получению новых данных о структуре полисахаридов планируется получение новых данных о структуре и биологических свойствах новых углеводсодержащих биополимеров – компонентов клеточной стенки и внеклеточных полисахаридах отдельных представителей морских бактерий, отнесенных к родам Vibrio, Echinimonas, Cobetia, Kangiella и др. Структура полисахаридов будет изучена с помощью современных физико-химических методов исследования биополимеров, главным образом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), ГЖХ-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) и ЯМР спектроскопии на ядрах 1H, 13C и 31P, включая двумерные корреляционные 1H,1H-гомоядерные и 1H,13C- и 1H,31P-гетероядерные (COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HSQC-TOCSY и HMBC) эксперименты. При необходимости для анализа и установления строения полисахаридов, содержащих редкие и необычные компоненты, будут применены адекватные методы избирательного расщепления и модификации полимеров. Изучение биологической активности выделенных биогликанов будет главным образом фокусироваться на антипролиферативных и иммуномодулируещих свойствах. Антипролиферативная активность будет изучаться in vitro с использованием широкой панели опухолевых линий. Кроме того, будут получены данные о цитотоксичности полисахаридов в отношении неопухолевых (нормальных) клеток. Исследования иммуномодулирующей активности будут проведены на моделях с использованием клеток периферической крови человека и на линии клеток макрофагов мыши RAW 264.7. Кроме того, важным предметом исследования будет поиск и идентификация биосинтетических генных кластеров биологически активных полисахаридов с использованием подходов сравнительной геномики морских бактерий. Результаты исследований существенно расширят арсенал природных биогликанов новыми вариантами химических структур, многие из которых не имеют аналогов среди биоактивных полисахаридов, выделенных из наземных источников. На основании полученных результатов будут даны рекомендации для поиска новых продуцентов биологически активных полисахаридов на основе геномного анализа. Выявленные закономерности биосинтеза полисахаридов могут быть использованы для получения и разработки новых терапевтических средств, биологических добавок и систем адресной доставки лекарственных препаратов, эффективных в отношении различных заболеваний. Предлагаемое исследование также является значимым в таких аспектах как расширение и фундаментальное подкрепление имеющихся представлений о составе, строении и взаимосвязи между структурой и функцией поверхностных углеводсодержащих биополимеров морских бактерий. Полученные в ходе проекта сведения о структуре могут внести существенный вклад в понимание процессов адаптации микроорганизмов к морской среде обитания.
4. В рамках проведения молекулярно-генетических и геномных исследований морских микроорганизмов в интересах биофармацевтики и биотехнологий планируется провести поиск среди штаммов КММ ТИБОХ ДВО РАН на наличие высокоактивных ферментов, катализирующих различные структурные превращения коммерчески ценных поланионных полисахаридов, таких как пектины, каррагинаны, альгинаты, ульваны и фукоиданы. Особое внимание будет уделено анализу геномов перспективных углевод-деградирующих морских микроорганизмов с целью поиска генов и их кластеров, кодирующих различные углевод-модифицирующие ферменты, в том числе ферментов с пока еще неизвестной специфичностью и механизмом действия. Планируется исследовать уникальные ферментные системы, участвующие в деградации и модификации сложных по структуре полианионных полисахаридов. Будут получены рекомбинантные аналоги перспективных углевод-модифицирующих ферментов класса гидролаз, а также ферментов с неизвестными функциями. С использованием широкой панели углеводных субстратов планируется определить их функциональную активность. При необходимости будут разработаны методы детекции новых функциональных активностей ферментов. Специфичность ферментов будет установлена с помощью анализа структур продуктов ферментативных реакций методами спектрального анализа. Методами биоинформатики, а также сайт-направленного мутагенеза будет определен механизм действия новых ферментов. В рамках проекта также планируется исследовать перспективность практического использования полученных рекомбинантных ферментов и их комплексов для направленного редактирования молекул полианионных поли- и олигосахаридов с целью получения новых структур с желаемыми реологическими и биологическими свойствами.
5. В рамках подготовки кадров в области микробиологии, геномики, биоорганической химии и молекулярной биотехнологии будет проведена 3-я Всероссийская школа-конференция молодых ученых и студентов «Генетические технологии в исследованиях природных соединений». Совместно с соисполнителем ДВФУ будет разработана и проведена Программа дополнительного профессионального образования (ДПО) «Избранные главы морской микробиологии» по направлению «Морская микробиология». Программа рассчитана на 72 академических часа и включает лекции, отражающие современные молекулярно-генетические методы исследования морских микробных биоресурсов, тестовые и экзаменационное задания. Для обучения и выполнения выпускных квалификационных работ по микробиологии, биоорганической химии и биотехнологии будут привлекаться студенты ДВФУ (бакалавры, магистранты и специалисты), а также студенты других регионов для выполнения программы научно-исследовательского проекта в рамках экспедиции «Тихоокеанский плавучий Университет». В рамках реализации данного исследовательского проекта с использованием генетических технологий планируется защита не менее 3 кандидатских диссертаций.
|
