| Аннотация |
В мире продолжается ускоренное развитие репортерных систем на основе
люминесцентных белков, проводятся исследования в молекулярной генетике,
биотехнологии и медицинских исследованиях, как для изучения регуляции генов,
так и для исследования различных веществ и сложных смесей с помощью lux-
биосенсоров.
В продолжение Проекта 2022 планируется с использованием разработанных
биосенсоров из набора BEsc провести исследования воды, донных отложений и
амфипод ряда водоемов России с целью осуществления экологического мониторинга
и определения механизма загрязнения оз. Байкал и арктических морей
алкилирующими соединениями. Наличие разработанных в рамках проекта
конструкций LuxAB-Frp для экспрессии генов бактериальной люциферазы,
направленной в митохондриальный матрикс, межмембранное пространство
митохондрий и цитоплазму, позволит провести исследования механизма
воздействия препаратов на основе трифенилфосфония на пул восстановительных
эквивалентов и макроэргических соединений в эукариотических клетках.
Планируется сконструировать стабильные линии клеток млекопитающих с
люциферазами LuxAB-Frp и Luc для токсикологических исследований новых
химических соединений и для тестирования эффективности генотерапевтических
препаратов, влияющих на окислительный потенциал митохондрий.
В рамках исследований, направленных на поиск и оптимизацию репортерных генов,
планируется клонировать luxAB-гены из Vibrio vulnificus RK27 (аральский
изолят), исследовать термостабильность люциферазы и определить скорость
оборота фермента.
Недавно нами было показано, что люминесценция клеток E. coli, экспрессирующих
lux-оперон бактерий рода Photorhabdus, усиливается при повышении температуры.
В связи с этим, в рамках продления данного проекта предполагается заменить
биосенсор в составе BEsc, подобрав конструкцию с постоянной светимостью, и
исследовать промотор lux-оперона бактерий рода Photorhabdus на предмет
возможного его использования в биосенсорах на тепловой шок.
Ранее в проекте 2022 нами проводились структурные исследования Lux-белков P.
luminescens и были получены кристаллы отдельных белков LuxAB и LuxC P.
luminescens. Предполагается дальнейшая характеризация полученных кристаллов
методом рентгеновской дифракции. Хотя структуру белка LuxR1 получить не
удалось, были подробно охарактеризованы все три белка: LuxR Aliivibrio
fischeri, LuxR1 и LuxR2 A. logei, ― с точки зрения термостабильности и
специфичности к различным аутоиндукторам. Выявленные свойства LuxR2 в клетках
E. coli уже были использованы для создания уникальной экспрессионной системы
с возможностью регуляции концентрацией аутоиндуктора и выключением/включением
сменой температуры культивации. В рамках данного проекта будет проверена
работоспособность LuxR2 и будет оценена его термостабильность и
чувствительность к аутоиндуктору в клетках Bacillus subtilis, что актуально
для развития экспрессионных систем на основе quorum sensing регуляции.
Будет проведен поиск новых люминесцирующих бактерий и популяционные
исследования люминесцирующей микрофлоры во внутренних водоёмах (Каспийское
море — летний период, Аральское — зимний) и в почве (Подмосковье, Северный
Кавказ, Краснодарский край). В 2023-2024 годах мы впервые сообщили о массовом
обнаружении в воде и рыбе Аральского моря светящихся бактерий, принадлежащих
видам V. vulnificus и Vibrio cholerae. Можно предположить, что в Аральском
море присутствуют сезонные колебания видового состава люминесцентной
микрофлоры, как это было показано ранее в акваториях Охотского и Берингова
морей.
Выполнение работ проекта 2025 позволит развить биолюминесцентные сигнальные
системы на основе клеток млекопитающих, вывести их на новый уровень,
позволяющий определять токсикологию новых химических соединений и
эффективность генотерапевтических препаратов. Также планируется улучшить
бактериальный набор lux-биосенсоров BEsc и продолжить работы по оптимизации
репортерных генов, основанных на бактериальных люциферазах.
|
