| Аннотация |
В заявленном проекте планируется использовать термогенетическую стимуляцию глутаматергических нейронов клиновидного ядра (cuneiform nucleus) локомоторного отдела среднего мозга для повышения эффективности реабилитации после травмы спинного мозга. Уже более десяти лет наша группа разрабатывает технологии термогенетической нейромодуляции. На первоначальных этапах работы были использованы змеиные термочувствительные каналы, относящиеся к суперсемейству рецепторов переходного потенциала (TRP), которые являются неселективными катионными каналами, проводящими преимущественно ионы кальция и натрия. С применением методов генной инженерии эти каналы были встроены в культивируемые нейроны, выделенные из головного мозга эмбрионов мышей. Было показано, что повышение локальной температуры нейронов с гетерологичной экспрессией змеиных термочувствительных каналов путем воздействия на них инфракрасного лазера, вызывает деполяризацию их мембраны и генерацию ими потенциалов действия [Ermakova Y. G. и др. Thermogenetic neurostimulation with single-cell resolution // Nat Commun. 2017. Т. 8. № 1. С. 15362]. Затем в модельном объекте рыбке Danio rerio была продемонстрирована двигательная реакция при термогенетической активации мотонейронов спинного мозга, в которые были доставлены термочувствительные каналы змей. Оказалось, что и термочувствительные каналы млекопитающих могут быть использованы для термогенетической нейромодуляции. Еще в одной работе нашего коллектива было показано, что после трансфекции генетическими конструктами in utero c помощью электропорации пирамидные нейроны коры экспрессируют канал TRPV1-L из летучей мыши, и активация этого канала с помощью инфракрасного лазера вызывает в них генерацию потенциалов действия [Roshchin M. и др. Thermogenetic stimulation of single neocortical pyramidal neurons transfected with TRPV1-L channels // Neuroscience Letters. 2018. Т. 687. С. 153–157]. Во всех предыдущих наших исследованиях были использованы термочувствительные каналы животных. В последние три года мы были сфокусированы на разработке технологии термогенетической нейромодуляции на основе использования термочуствительного канала TRPV1 человека. Эти исследования проводились в рамках гранта № 075–15-2019–1789 Министерства высшего образования и науки Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Канал TRPV1 человека имеет пороговую температуру активации около 42 град С. Использование канала человека в качестве инструмента делает технологию термогенетической нейромодуляции потенциально транслируемой в медицину. Нами были созданы генетические конструкции для гетерологичной экспрессии канала в модельных клетках. В экспериментах на клеточных культурах было показано, что канал, несмотря на порог активации в 42 град С, может открываться быстрыми нагревами с 37 град С до 39-41 град С, т.е. нагревами в безопасном диапазоне температур.
Далее была создана генетическая конструкция для эксспрессии канала избирательно в глутаматергических нейронах, которая затем была упакована в частицы рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Введение такого вируса в мозг модельных животных (мышей) приводит к экспрессии канала в возбуждающих нейронах. Нагрев трансдуцированных нейронов в переживающих срезах головного мозга мышей с помощью инфракрасного лазера вызывает деполяризацию клеточной мембраны и генерацию потенциалов действия. Для того, чтобы продемонстрировать поведенческие эффекты применения термогенетической нейромодуляции in vivo, мышам в клиновидное ядро, ответственное за инициацию движений, был введен вирус и затем имплантирован оптический интерфейс. Нагрев клиновидного ядра с помощью инфракрасного лазера через оптический интерфейс вызывал заметные поведенческие реакции, выражающиеся в виде увеличения скорости движения животных по арене. Нагревы такой же мощности не вызывали никакой реакции у контрольных животных. Оказалось, что такую стимуляцию можно повторять несколько дней подряд без потери величины эффекта. Это означает, что оказываемое температурное воздействие не вызывает повреждения тканей мозга, и термогенетическая нейромодуляция может применятся хронически. В совокупности эти результаты были опубликованы в виде статьи в 2024 г. [Maltsev D. I. и др. Human TRPV1 is an efficient thermogenetic actuator for chronic neuromodulation // Cell. Mol. Life Sci. 2024. Т. 81. № 1. С. 437] и представлены на трех конференциях: (1) Подгорный О.В. «Визуализация биохимических параметров и управление активностью нервных клеток свободноподвижных животных с применением оптоволоконной техники», Акустооптические и радиолокационные методы измерений и обработки информации: Труды XVII Международной научно-технической конференции, Суздаль, 23–26 сентября 2024 года. – Москва: Научно-технологический центр уникального приборостроения РАН, 2024. – С. 292-294. – EDN LCCXZJ. https://elibrary.ru/download/elibrary_75064499_79441506.pdf; (2) Podgorny O.V., Maltsev D.I., Solotenkov M.A., Mukhametshina L.F., Sokolov R.A., Solius G.M., Jappy D., Tsopina A.S., Fedotov I.V., Lanin A.A., Fedotov A.B., Krut’ V.G., Moshchenko A.A., Rozov A., Zheltikov A.M., Belousov V.V. “Thermogenetic control of neuronal circuits in vivo”, Abstracts of International Conference “Biomembranes’24”, Dolgoprudny, October 7-11, 2024, P. 80. https://biomembranes.events/#rec802849792. Ссылка на поддержку грантом РНФ указана в тезисах. Приглашенный доклад. (3) Подгорный О. В., Мухаметшина Л.Ф., Солотёнков М. А., Солюс Г.М., Мальцев Д. И., Ланин А. А., Джаппи Д., Федотов И.В., Федотов A.Б., Соколов Р.А., Мощенко А. А., Розов А. В., Жёлтиков А.М., Белоусов В.В., «Термогенетическая модуляция нервных сетей in vivo», приглашенный устный доклад на XXIV Съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 11–15 сентября 2023 г., г. Санкт-Петербург, https://rusphysiol2023.iephb.ru.
Нами получены модифицированные версии канала TRPV1 человека. Так, путем сайт-направленного мутагенеза получена версия канала, которая не обладает кальциевой проводимостью. Применение такой версии канала в качестве термогенетического инструмента для управления трансмембранным транспортом катионов позволяет исключить риск повреждения и гибели возбудимых клеток в результате перегруза их ионами кальция [Патент на изобретение № 2784086 от 23.11.2022, Нуклеиновая кислота, кодирующая термочувствительный канал TRPV1 человека с измененной ионной селективностью для управления мембранным потенциалом клеток. Подгорный О.В., Солюс Г.М., Розов А.В., Белоусов В.В.]. Помимо этого, мы получили укороченную версию канала (-110аа)hTRPV1, которая проявляет такую же функциональную активность как и полноразмерный hTRPV1 [Balatskiy A. V. и др. Thermogenetics for cardiac pacing // 2024]. Использование укороченной версии канала актуально для генной терапии с применением аденоассоциированных вирусов, емкость которых ограничена.
Один год назад нами были начаты работы совместно с НТЦ УП РАН по применению сфокусированного ультразвука для термогенетической нейромодуляции. За это время был сконструирован генератор ультразвуковых колебаний высокой интенсивности, собран миниатюрный однокомпонентный преобразователь, производящий сходящиеся в один фокус звуковые волны, спроектирована и реализована конструкция для крепления миниатюрного преобразователя на поверхности черепа модельных животных и проведена калибровка температурного воздействия созданной системы на фантоме. Для демонстрации возможности применения сфокусированного ультразвука для термогенетической нейромодуляции мышам в клиновидное ядро вводили вирус для экспрессии TRPV1 человека в глутаматергических нейронах, а затем монтировали на поверхность черепа держатель для ультразвукового преобразователя. Подавая переменное напряжение ультразвуковой частоты и различной амплитуды, мы показали, что животные с термочуствительным каналом начинают активно двигаться по арене. Тогда как аналогичное воздействие не вызывало реакции у контрольных мышей. Таким образом, мы продемонстрировали возможность применения сфокусированного ультразвука для неинвазивной термогенетической стимуляции. Результаты этих исследований были представлены в пленарной лекции «Синтетические и клеточные нейротехнологии: из лаборатории в медицину», представленной член-корреспондентом РАН В.В. Белоусовым на Всероссийская Конференции с международным участием «Оптогенетика+ 2025», https://optogenetics2025.iephb.ru/informaczionnye-pisma/.
Таким образом, мы обладаем всеми необходимыми технологиями и инструментами для реализации оптоволоконной и ультразвуковой термогенетической стимуляции глутаматергических нейронов клиновидного ядра локомоторного отдела среднего мозга в модели неполного повреждения спинного мозга. Предлагаемый к реализации проект имеет высокий трансляционный потенциал, поскольку в его основе лежит использование канала TRPV1 человека и технология неинвазивного нагрева тканей мозга с помощью сфокусированного ультразвука.
|
